La conoscenza dei test diagnostici per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua ad evolversi ed è importante una chiara comprensione della natura dei test e dell’interpretazione dei loro risultati.
Questo punto di vista descrive come interpretare 2 tipi di test diagnostici comunemente in uso per le infezioni da SARS-CoV-2: reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) e test immunoassorbente legato a un enzima IgM e IgG (ELISA). - e come i risultati possono variare nel tempo.
Rilevazione dell’RNA virale mediante RT-PCR
Fino ad ora, il test più comunemente utilizzato e affidabile per la diagnosi di COVID-19 è stato il test RT-PCR eseguito utilizzando tamponi nasofaringei o altri campioni del tratto respiratorio superiore, inclusi tamponi faringei o, più recentemente, saliva.
Diversi produttori utilizzano una varietà di bersagli genetici dell’RNA, con la maggior parte dei test mirati a 1 o più geni: involucro (ENV), nucleocapside (N), picco (S), RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) e ORF1.
La sensibilità dei test ai singoli geni è paragonabile secondo studi comparativi, ad eccezione della sonda di priming RdRp-SARSr (Institut Charité), che ha una sensibilità leggermente inferiore, probabilmente a causa di una mancata corrispondenza nel priming inverso. 1
Nella maggior parte delle persone con infezione sintomatica da COVID-19, l’RNA virale misurato dalla soglia del ciclo (Ct) viene rilevato già nel primo giorno dei sintomi e raggiunge il picco nella prima settimana di insorgenza dei sintomi. . Il Ct è il numero di cicli di replicazione necessari per produrre un segnale fluorescente; valori Ct più bassi rappresentano carichi di RNA virale più elevati. Un valore Ct inferiore a 40 è clinicamente segnalato come PCR positivo.
Questa positività inizia a diminuire nella settimana 3 e successivamente diventa non rilevabile. Tuttavia, i valori Ct ottenuti nei pazienti ospedalizzati gravemente malati sono inferiori ai valori Ct nei casi lievi e la positività alla PCR può persistere oltre 3 settimane dopo l’esordio della malattia, quando la maggior parte dei casi lievi produrrà un risultato negativo.2 Tuttavia, un “ positivo” il risultato della PCR riflette solo il rilevamento dell’RNA virale e non indica necessariamente la presenza di virus vitali.3
In alcuni casi, l’RNA virale è stato rilevato mediante RT-PCR anche oltre la sesta settimana dopo il primo test positivo. Alcuni casi sono stati segnalati positivi anche dopo 2 test PCR negativi consecutivi eseguiti a 24 ore di distanza. Non è chiaro se si tratti di un errore del test, di una reinfezione o di una riattivazione.
In uno studio su 9 pazienti, i tentativi di isolare il virus in coltura non hanno avuto successo oltre l’ottavo giorno dall’esordio della malattia, che è correlato al declino dell’infettività oltre la prima settimana.3
Questo è in parte il motivo per cui la "strategia basata sui sintomi" del CDC indica che gli operatori sanitari possono tornare al lavoro "se sono trascorsi almeno 3 giorni (72 ore) dal recupero, definito come risoluzione". della febbre senza l’uso di farmaci e miglioramento dei sintomi respiratori (es. tosse, mancanza di respiro); e sono trascorsi almeno 10 giorni dalla comparsa dei sintomi."4
La cronologia della positività alla PCR è diversa nei campioni diversi dal tampone nasofaringeo. La positività alla PCR diminuisce più lentamente nell’espettorato e può ancora essere positiva dopo che i campioni nasofaringei sono negativi. 3
In uno studio, la positività alla PCR delle feci è stata osservata in 55 pazienti su 96 (57%) infetti ed è rimasta positiva nelle feci oltre il tampone nasofaringeo per un periodo compreso tra 4 e 11 giorni, ma non era correlata alla gravità clinica. 2 La persistenza della positività alla PCR nell’espettorato e nelle feci è risultata simile, come valutato da Wölfel et al.3
In uno studio su 205 pazienti con infezione confermata da COVID-19, la positività alla RT-PCR è stata più alta nei campioni di lavaggio broncoalveolare (93%), seguiti da espettorato (72%), tampone nasale (63%) e tampone faringeo (32%) .5 Risultati falsi negativi si sono verificati principalmente a causa di tempi inappropriati di raccolta dei campioni in relazione all’insorgenza della malattia e a carenze nella tecnica di campionamento, in particolare nei tamponi nasofaringei.
La specificità della maggior parte dei test RT-PCR è del 100% perché il disegno del primer è specifico per la sequenza del genoma SARS-CoV-2. Occasionalmente possono verificarsi risultati falsi positivi a causa di errori tecnici e contaminazione dei reagenti.
Rilevazione di anticorpi contro SARS-CoV-2
L’infezione da COVID-19 può anche essere rilevata indirettamente misurando la risposta immunitaria dell’ospite all’infezione da SARS-CoV-2.
La diagnosi sierologica è particolarmente importante per i pazienti con malattia da lieve a moderata che può presentarsi tardivamente, oltre le prime 2 settimane dall’esordio della malattia.
Anche la diagnosi sierologica sta diventando uno strumento importante per comprendere l’entità del COVID-19 nella comunità e identificare le persone immuni e potenzialmente “protette” dal contrarre l’infezione.
Il marcatore sierologico più sensibile e precoce sono gli anticorpi totali, i cui livelli cominciano ad aumentare a partire dalla seconda settimana dopo la comparsa dei sintomi. 6
Anche se mediante ELISA le IgM e le IgG sono risultate positive già dal quarto giorno dopo la comparsa dei sintomi, i livelli più elevati si riscontrano nella seconda e terza settimana di malattia.
Ad esempio, la sieroconversione IgM e IgG si è verificata in tutti i pazienti tra la terza e la quarta settimana dall’esordio della malattia clinica, come misurato successivamente in 23 pazienti da To et al.7 e in 85 da Xiang et al.8. Le IgM iniziano a diminuire e raggiungono livelli più bassi alla settimana 5 e quasi scompaiono alla settimana 7, mentre le IgG persistono oltre le 7 settimane. 9
In uno studio su 140 pazienti, la sensibilità combinata di PCR e IgM mediante ELISA mirato all’antigene nucleocapside (N) è stata del 98,6% rispetto al 51,9% con un singolo test PCR. Durante i primi 5,5 giorni, la PCR quantitativa ha avuto un tasso di positività più elevato rispetto alle IgM, mentre le IgM (ELISA) hanno avuto un tasso di positività più elevato dopo il 5,5 giorno di malattia. 10
I test sugli anticorpi IgM e IgG basati su ELISA hanno una specificità superiore al 95% per la diagnosi di COVID-19. L’analisi dei campioni di siero abbinati alla PCR iniziale e alla seconda due settimane dopo può aumentare ulteriormente l’accuratezza della diagnosi. Tipicamente, la maggior parte degli anticorpi vengono prodotti contro la proteina più abbondante del virus, ovvero N.
Pertanto, i test che rilevano gli anticorpi contro N sarebbero i più sensibili. Tuttavia, la proteina S del dominio legante il recettore (RBD-S) è la proteina legante l’ospite e gli anticorpi contro RBD-S sarebbero più specifici e si prevede che siano neutralizzanti. Pertanto, l’uso di uno o entrambi gli antigeni per rilevare IgG e IgM comporterebbe un’elevata sensibilità. 7 Tuttavia, gli anticorpi possono avere reattività crociata con la SARS-CoV e possibilmente con altri coronavirus.
I test rapidi per la rilevazione degli anticorpi sono stati ampiamente sviluppati e commercializzati e sono di qualità variabile. Molti produttori non rivelano la natura degli antigeni utilizzati. Questi test sono di natura puramente qualitativa e possono solo indicare la presenza o l’assenza di anticorpi contro SARS-CoV-2.
La presenza di anticorpi neutralizzanti può essere confermata solo da un test di neutralizzazione con riduzione della placca. Tuttavia, è stato dimostrato che titoli elevati di anticorpi IgG rilevati mediante ELISA sono correlati positivamente con anticorpi neutralizzanti. 7
La persistenza e la durata a lungo termine della protezione conferita dagli anticorpi neutralizzanti non sono note.
Conclusioni
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