La définition d’ une culture d’urine positive fait l’objet de controverses depuis des décennies. L’utilisation d’un seuil de 100 000 unités formant colonies par millilitre (UFC/mL) pour définir l’infection des voies urinaires (IVU) chez les patients adultes reposait en grande partie sur une petite étude cas-témoins rapportée par Kass1 en 1956 dans laquelle comparait les résultats de culture d’urine de les femmes présentant une pyélonéphrite cliniquement diagnostiquée et des témoins asymptomatiques ; la plupart des femmes atteintes de pyélonéphrite avaient un nombre de colonies supérieur à 100 000 UFC/mL et la plupart des femmes asymptomatiques avaient un nombre de colonies inférieur à 10 000 CFU/mL.
Près de 30 ans plus tard, dans une étude transversale portant sur de jeunes enfants ayant subi un cathétérisme vésical pour exclure une infection urinaire, Hoberman et ses collègues ont comparé les caractéristiques des enfants dont la croissance était comprise entre 10 000 et 49 000 CFU/mL et entre 50 000 et 99 000 CFU/mL.2 Parmi les 35 échantillons avec une croissance comprise entre 10 000 et 99 000 CFU/mL, des coques à croissance mixte et/ou Gram positif ont été observées plus fréquemment chez les enfants avec un nombre de colonies de 10 000 à 49 000 CFU/mL par rapport aux enfants avec un nombre de colonies de 50 000 à 99 000 CFU. /ml.
Depuis lors, la limite de 50 000 est le seuil accepté pour l’interprétation des résultats de culture à partir d’échantillons collectés par cathétérisme chez des enfants de moins de 2 ans.3 Cependant, en raison d’une norme de référence indépendante de la culture dans aucune de ces 2 études, ils ne peuvent ne doit être considérée qu’à titre de clarification4 et ne peut fournir que des approximations d’une limite qui pourraient être utiles en pratique clinique.
En fait, des problèmes ont été signalés avec la limite pédiatrique actuellement acceptée de 50 000 CFU/mL. Un exemple notable vient d’une étude de Swerkersson et al. 5 dans laquelle une proportion considérable de jeunes enfants atteints de pyélonéphrite radiologiquement confirmée présentaient un nombre de colonies inférieur à la limite actuellement acceptée de 50 000 UFC/mL.
Pour étudier les compromis entre sensibilité et spécificité à différents seuils, une étude transversale est nécessaire dans laquelle une culture d’urine (le test index) et un étalon de référence indépendant de la culture sont réalisés sur des échantillons non sélectionnés provenant de sujets en pour qui il est cliniquement judicieux de suspecter une infection urinaire.
Les progrès récents dans le séquençage 16S, qui utilise la séquence exacte du gène hautement conservé de l’ARN ribosomal (ARNr) 16S pour identifier les bactéries présentes dans les échantillons, nous fournissent désormais une norme de référence sensible et relativement impartiale pour l’identification des organismes dans l’urine.
Dans une étude précédente, ils ont trouvé une concordance élevée entre le séquençage conventionnel de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S par culture urinaire (ci-après dénommé séquençage 16S) dans une cohorte de jeunes enfants (ne chevauchant pas la cohorte actuelle) qui sont évalués pour les infections urinaires. .6
Dans cette cohorte de jeunes enfants fébriles subissant un cathétérisme vésical pour exclure une infection des voies urinaires, en utilisant le séquençage 16S comme étalon de référence, les auteurs ont calculé l’exactitude de la culture conventionnelle à différents seuils pour identifier celle qui fournit l’équilibre optimal. entre sensibilité et spécificité.
| Méthodes |
Entre juin 2019 et mai 2020, ils ont inscrit des enfants consécutifs qui se sont présentés au service des urgences de l’hôpital pour enfants de Pittsburgh et qui avaient encore de l’urine après avoir terminé tous les tests cliniques. L’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Pittsburgh.
Les enfants étaient inclus s’ils étaient âgés de 1 mois à 2 ans et 11 mois, avaient de la fièvre (température documentée ≥ 38°C aux urgences ou selon le rapport des parents) dans les 24 heures suivant leur présentation et avaient subi une prise de sang. échantillon d’urine via un cathéter pour exclure une infection urinaire.
Ils ont exclu les nouveau-nés car cette étude fait partie d’une étude plus vaste examinant les biomarqueurs de la pyélonéphrite. Le diagnostic de pyélonéphrite repose sur la réalisation d’une scintigraphie rénale, difficile à réaliser chez le nouveau-né.
Les enfants étaient exclus s’ils avaient reçu des antibiotiques ou des corticostéroïdes systémiques dans les 3 jours précédant l’inscription, s’ils présentaient d’autres infections bactériennes systémiques concomitantes, s’ils étaient immunodéprimés, s’ils avaient une vessie neurogène ou s’ils présentaient des anomalies génito-urinaires importantes (par exemple, spina bifida, reins dysplasiques). , reflux vésico-urétéral de grade IV ou IV).
Une culture d’urine conventionnelle a été réalisée dans le laboratoire de microbiologie clinique de l’hôpital à l’aide de méthodes microbiologiques standard et le nombre d’unités formant colonies (UFC)/mL a été rapporté comme étant < 10 000, 10 000 à 49 000, 50 000 à 99 000 et ≥ 100 000.
> Traitement des échantillons d’urine pour le séquençage 16S
Une aliquote d’urine résiduelle a été utilisée pour le séquençage 16S. L’aliquote a généralement eu lieu dans l’heure suivant le prélèvement ; toutefois, si des retards étaient prévus, les échantillons étaient conservés au réfrigérateur.
L’aliquote a été congelée dans un cryovial à -80 ° C sans conservateur. Avant l’expédition, ils ont ajouté 70 µL de tampon de conditionnement d’urine (Zymo, D3061-1-8) pour 1 ml d’échantillon d’urine congelé. Les échantillons ont été expédiés pendant la nuit dans un emballage froid au laboratoire Pangea, Tustin, Californie, États-Unis, pour une analyse de séquençage 16S à l’aide du test microbien PrecisionBIOME NGS.
L’ADN a été extrait de l’échantillon urinaire à l’aide du kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep conformément aux instructions du fabricant (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). L’ADN extrait a été préparé pour l’analyse du microbiome selon le flux de travail PrecisionBIOME, qui comprenait la préparation de bibliothèques à l’aide du kit de préparation Quick-16S NGS (régions V1-3, Zymo Research Corporation, Irvine, Californie), le séquençage d’amplicons à codes-barres avec la plateforme de séquençage MiSeq (Illumina , San Diego, Californie) et analyse bioinformatique à l’aide de la pipette bioinformatique PrecisionBIOME capable de produire une résolution au niveau de l’espèce des séquences bactériennes et fongiques (les données sur les champignons présents et les cytokines seront rapportées séparément).
Des contrôles négatifs (milieu de transport seul et écouvillons non utilisés) ont été inclus. Pour contrôler la contamination, ils ont également inclus des cellules et des communautés d’ADN simulées comme contrôles positifs. Les erreurs de séquençage possibles et les séquences chimériques ont été supprimées avec la pipette DADA2.
> Traitement des données de séquençage 16S
Ils ont utilisé Uclust pour effectuer des classifications taxonomiques à l’aide d’une base de données personnalisée de PrecisionBIOME. Ils ont calculé les phylotypes sous forme de pourcentages basés sur le nombre total de séquences dans chaque échantillon.
La résolution au niveau de l’espèce de cette approche de séquençage a été précédemment confirmée par séquençage par fusil de chasse.7 Nous avons exclu les échantillons contenant <1 000 séquences par échantillon.
> Condition cible en cours de diagnostic
Dans une étude précédente réalisée entre 2011 et 20176, les auteurs ont constaté un taux de concordance élevé entre les cultures d’urine conventionnelles et le séquençage 16S dans l’identification des bactéries dans les urines. Ceci établi, les auteurs ont estimé qu’il était désormais approprié dans le cadre de cette étude exploratoire de substituer le séquençage 16S à la culture d’urine dans le diagnostic des infections urinaires (la pathologie cible).
En pratique clinique, en plus de la présence d’une bactériurie dans la culture, une élévation des marqueurs inflammatoires est nécessaire pour diagnostiquer une infection urinaire.3
Par conséquent, pour diagnostiquer l’IVU dans le contexte de cette étude de validation de principe, en plus d’exiger que ≥ 80 % des séquences appartiennent à un seul taxon (c’est-à-dire, abondance relative de tout taxon ≥ 80 %), ils nécessitent également le élévation des marqueurs urinaires de l’inflammation.
En construisant leur standard de référence, les auteurs ont choisi un seuil de 80 % (pour l’analyse primaire) car ils estimaient qu’en tant que médecins, ils seraient obligés de diagnostiquer une infection urinaire chez un enfant fébrile présentant des marqueurs urinaires d’inflammation dont l’urine était à ce niveau. niveau. de bactériurie.
Le reste des enfants ont été classés comme « sans infection urinaire ». À titre d’analyse de sensibilité, nous avons également examiné les résultats en utilisant des limites d’abondance relative de 50 % et 90 %.
> Marqueurs urinaires de l’inflammation
Chaque enfant a subi une analyse d’urine microscopique dans laquelle les globules blancs (WBC) ont été observés (par millimètre cube ou par champ de puissance élevée) et un test de bandelette réactive dans lequel le test de l’estérase leucocytaire a été rapporté. forme semi-quantitative (aucun, accident vasculaire cérébral, 1+, 2+, 3+).
Étant donné que la sensibilité des tests de leucocytes et d’estérase leucocytaire est généralement faible8, ils ont également mesuré, à l’aide de méthodes utilisées dans des études antérieures9, la lipocaline associée à la gélatinase neutrophile (NGAL) dans une aliquote d’urine résiduelle.
Le NGAL est un marqueur inflammatoire libéré par les neutrophiles ou les cellules intercalées dans le rein en réponse à une infection urinaire.9,10 Bien que l’utilisation du NGAL urinaire pour le diagnostic des infections urinaires soit un développement relativement récent, compte tenu des preuves solides soutenant son utilisation pour diagnostiquer les infections urinaires, 10, les auteurs ont décidé, a priori, de classer un enfant comme présentant des signes d’inflammation si l’un des éléments suivants était présent : ≥10 WBC/mm3, ≥5 WBC par champ de puissance élevée (Hpf), ≥traces d’estérase leucocytaire ou taux de NGAL supérieur. supérieure à 39,9 ng/mL.10 Ils ont effectué une analyse de sensibilité examinant les résultats s’ils n’avaient pas considéré le NGAL comme un marqueur de l’inflammation.
> Test d’index en évaluation
Les auteurs ont défini les résultats de culture conventionnelle comme positifs si la culture d’urine montrait la croissance d’au moins 1 organisme avec un nombre d’au moins 10 000 UFC/mL et si au moins 1 des marqueurs urinaires de l’inflammation était élevé. Les autres seuils évalués étaient de 50 000 CFU/mL et 100 000 CFU/mL.
> Analyse statistique
Pour l’analyse principale, ils ont calculé la sensibilité et la spécificité de la culture d’urine pour détecter les infections urinaires (en utilisant un seuil d’abondance relative de 90 % chez un enfant présentant des marqueurs urinaires d’inflammation), ainsi que les intervalles de confiance de Wald correspondants à 95 %. Ils ont ensuite répété les analyses en utilisant différentes définitions de l’IVU (c’est-à-dire en utilisant des limites d’abondance relative de 50 % et 80 % au lieu de 90 %). Ils ont résumé et analysé les données à l’aide de SAS version 9.4 (SAS Institute Inc).
| Résultats |
Au total, 341 enfants ont été inclus dans l’étude. La majorité des enfants inscrits étaient des filles (74 %), des Blancs (67 %) et la majorité (64 %) avaient une température documentée de 39°C ou plus. L’âge moyen des enfants au moment du diagnostic était de 12,5 mois et la température moyenne à la présentation était de 39,3°C. Chez les enfants présentant des marqueurs urinaires d’inflammation mais sans au moins 1 organisme avec un nombre de cultures de 10 000 UFC/mL ou plus, l’abondance relative médiane des organismes identifiables prédominants était de 15 % (intervalle interquartile : 7 % à 32 %).
En utilisant un seuil d’abondance relative de 80 %, 46 enfants de cet échantillon avaient une infection urinaire. Parmi ceux-ci, 41 (89 %) avaient E. coli comme agent pathogène prédominant. Lorsqu’un seuil ≥ 10 000 est utilisé pour définir une culture d’urine positive, parmi 46 enfants atteints d’infection urinaire, 45 ont été correctement identifiés par culture d’urine conventionnelle (sensibilité 98 %, intervalle de confiance [IC] : 93 % à 100 %).
L’enfant disparu était un nourrisson de 4 mois présentant une estérase leucocytaire 3+ sur bandelette réactive, un nombre de leucocytes de 73 par Hpf, un NGAL élevé de 319, chez lequel des séquences > 99 % ont été identifiées par séquençage 16S attribué à l’espèce. de Klebsiella . En culture, cet enfant avait <10 000 CFU/ml d’organismes à Gram négatif et <10 000 CFU de coques à Gram positif ; aucun autre organisme n’a été identifié en raison du faible nombre de colonies. Parmi les 295 enfants sans infection urinaire, 291 ont été correctement identifiés comme tels par culture conventionnelle (spécificité de 99 %, IC : 97 % à 100 %).
L’utilisation d’un seuil ≥ 50 000 UFC/ml a diminué la sensibilité des cultures d’urine à 80 % (IC à 95 % : 68 % à 93 %). Changer le seuil à 50 000 a eu un effet négligeable sur la spécificité (c’est-à-dire que la spécificité est restée à 99 %, IC : 98 % à 100 %). Les 8 enfants supplémentaires atteints d’infections urinaires qui auraient été manqués si une limite de 50 000 avait été utilisée ; tous les enfants avec des infections urinaires manquées présentaient des organismes actuellement considérés comme uropathogènes et, par définition, tous étaient symptomatiques et présentaient des niveaux élevés de marqueurs urinaires d’inflammation.
L’utilisation d’un seuil de 100 000 UFC/mL aurait réduit la sensibilité à 70 % (IC à 95 % : 55 % à 84 %). Les changements dans la définition de la norme de référence ont eu peu d’effet sur les estimations de précision.
Les estimations de sensibilité et de spécificité auraient été similaires si elles n’avaient pas inclus le NGAL comme marqueur de l’inflammation.
| Discussion |
Des études antérieures ont tenté de comprendre les résultats des cultures d’urine en comparant le nombre de colonies dans des conditions extrêmes (c’est-à-dire pyélonéphrite versus asymptomatique)1 ou en comparant les caractéristiques des sujets à certaines limites hautes et basses du nombre de colonies.2
De telles conceptions d’étude, bien que nécessaires au cours des premières phases exploratoires de la recherche sur les tests de diagnostic, ne peuvent pas fournir une véritable évaluation de l’exactitude d’un test dans la pratique clinique, ni être utilisées pour identifier des seuils qui optimisent la sensibilité et la spécificité. 4
Ici, en utilisant le séquençage 16S comme méthode de référence pour le diagnostic des infections urinaires, les auteurs ont pu évaluer l’exactitude diagnostique de la culture d’urine à diverses limites du nombre de colonies.
Ils ont constaté que, dans les cas d’enfants fébriles de moins de 3 ans subissant un cathétérisme vésical pour exclure une infection urinaire, l’utilisation d’un nombre de colonies de 10 000 CFU/ml aurait entraîné moins de cas d’infection urinaire manquée que l’utilisation d’un nombre de colonies de 50 000 CFU. /mL (manque 20 % des cas) ou 100 000 CFU/ml (manque 30 % des cas).
Selon le plan de l’étude, tous les enfants présentant une infection urinaire manquée présentaient des marqueurs urinaires d’inflammation élevés et étaient fébriles. Par conséquent, les données suggèrent qu’un seuil de 10 000 UFC/mL différencie mieux les jeunes enfants avec et sans véritable infection urinaire.
Il existe de nombreuses raisons pour lesquelles le séquençage 16S, notamment lorsqu’il est associé à des marqueurs urinaires de l’inflammation, constitue une norme de référence appropriée pour le diagnostic des infections urinaires.
Premièrement, contrairement à la culture d’urine, qui est optimisée pour détecter E. coli , l’analyse par séquençage 11 16S fournit une évaluation largement impartiale des bactéries présentes dans l’urine. En fait, un nombre croissant de preuves12,13 suggèrent que les résultats de l’analyse du séquençage 16S s’alignent bien avec les résultats de la culture d’urine quantitative élargie, une variation plus sensible de la culture d’urine qui utilise des milieux de culture supplémentaires, des volumes d’urine plus importants pour inoculer la culture sur plaques. , des temps d’incubation plus longs et une variété de conditions atmosphériques.14,15
Cependant, même si les données sur la plus grande sensibilité du séquençage 16S par rapport à la culture d’urine semblent incontestables, sa plus grande sensibilité pourrait en théorie se faire au prix d’une moindre spécificité, notamment en raison de l’étape d’amplification requise. Ainsi, on pourrait imaginer un scénario dans lequel de nombreux organismes cliniquement non pertinents pourraient être identifiés par séquençage 16S, conduisant à un grand nombre de diagnostics inappropriés d’infections urinaires.
Dans cette étude, cependant, l’utilisation du séquençage 16S (avec des marqueurs inflammatoires) a révélé un seul enfant chez lequel une infection urinaire n’avait pas été détectée. Cela suggère que l’analyse du séquençage 16S (à un seuil d’abondance relative de 80 %), combinée à des marqueurs inflammatoires de l’inflammation, constituait une norme de référence appropriée à utiliser dans cette étude.
Lorsqu’ils ont commencé cette étude, les auteurs craignaient d’utiliser une mesure relative de l’abondance comme référence standard. Cependant, les résultats (de cette étude et de la précédente) montrent que, pour le diagnostic des infections urinaires, l’abondance relative du séquençage 16S et les résultats de culture absolue étaient étonnamment similaires.
Les auteurs ont émis l’hypothèse que pour qu’un agent pathogène tel que E. coli représente 80 % ou plus de toutes les lectures d’échantillons dans le séquençage 16S, son nombre de copies de gènes devrait dépasser le nombre combiné16 de toutes les autres bactéries normalement présentes. dans le cadre de l’urobiome par quatre. Ainsi, le seuil d’abondance relative de 80 % ne sera atteint que lorsque l’abondance absolue d’un uropathogène est assez élevée.
Les résultats soutiennent l’utilisation continue de la culture d’urine (au moins une limite de 10 000 UFC/mL) dans la population étudiée. Cependant, en raison des progrès technologiques continus en matière de précision, de rapidité et de coût du séquençage 16S, il pourrait bientôt être disponible dans les centres cliniques. Si cela se produit, l’identification des organismes pourrait être réalisée en quelques heures au lieu de quelques jours. Il est donc important que des études comparatives soient menées pour établir les avantages et les inconvénients de l’utilisation de cette technologie en milieu clinique.
Plusieurs limites de cette étude doivent être prises en compte. Ils ont utilisé une définition de l’infection urinaire qui exigeait la présence de symptômes, des marqueurs urinaires élevés d’inflammation et une abondance relative élevée d’organismes dans l’analyse de séquençage 16S. L’utilisation d’une définition moins stricte (par exemple, ne pas exiger de marqueurs urinaires d’inflammation) aurait pu conduire à un taux plus élevé d’infections urinaires non détectées, mais ils auraient été moins certains que toutes ces infections urinaires représentaient de véritables infections urinaires.
Le choix de 80 % pour le seuil d’abondance relative requis pour définir l’IVU, bien que basé sur les données d’une étude antérieure des auteurs, était cependant, dans une certaine mesure, arbitraire. Ils reconnaissent que des organismes moins abondants peuvent également être capables de provoquer des maladies importantes.
Bref, comme l’a démontré l’analyse de sensibilité, le seuil choisi pour l’analyse primaire a eu peu d’influence sur les conclusions. Cela est probablement dû au fait que, dans la plupart des cas, les échantillons étaient dominés par des séquences provenant d’un seul uropathogène connu ou contenaient une très faible abondance d’une variété d’organismes qui, dans des études précédentes, avaient été détectés dans des échantillons d’urine de personnes asymptomatiques.14
Les résultats ne s’appliquent directement qu’aux enfants qui subissent un cathétérisme vésical pour exclure une infection urinaire ; Une limite plus élevée pour la culture d’urine peut être nécessaire s’il y a plus de contamination, par exemple liée à la méthode de collecte. Les auteurs n’ont pas utilisé de conservateurs avant de congeler les échantillons ; Cependant, les échantillons n’ont jamais été laissés à température ambiante et les résultats ne suggèrent aucun biais dû à l’approche utilisée.
Le laboratoire clinique n’a pas fourni de décompte précis des colonies pour les cultures d’urine conventionnelles ; Cela aurait pu être utile pour localiser le seuil inférieur à 50 000 UFC/mL qui optimisait au mieux la sensibilité et la spécificité de la culture urinaire. La majorité des infections urinaires dans cet échantillon étaient causées par E. coli .
Des études plus vastes sont nécessaires pour examiner plus en détail l’exactitude des seuils de comptage des colonies pour les uropathogènes moins courants.
Enfin, le séquençage 16S, bien que moins biaisé que la culture d’urine, peut être sujet à certains biais, notamment lorsque la biomasse dans les échantillons est relativement faible17 ; cependant, il est peu probable que ces biais modifient le modèle observé, passant d’un modèle dans lequel de nombreux organismes sont présents en abondances relativement faibles à un modèle dans lequel l’échantillon est dominé par un seul organisme.
Les points forts de l’étude comprenaient le recrutement consécutif d’enfants symptomatiques suspectés d’infection urinaire, l’utilisation d’un standard de référence basé sur des données antérieures, la performance du test index et du standard de référence chez tous les enfants inclus, l’utilisation de définitions cliniques a priori, la utilisation de contrôles positifs et négatifs pendant l’extraction et le séquençage, et utilisation d’une approche de séquençage validée.
Inévitablement, l’abaissement du seuil de diagnostic des infections urinaires de 50 000 CFU/mL à 10 000 CFU/mL augmentera le nombre d’enfants faussement étiquetés comme ayant une infection urinaire. Cependant, cela est approprié car (1) le nombre d’enfants faussement étiquetés comme ayant une infection urinaire sera inférieur au nombre d’enfants avec des infections urinaires manquées qui seront découverts, et (2) les conséquences négatives de l’omission d’une infection urinaire fébrile l’emportent généralement sur celles-ci. de prescrire un traitement supplémentaire d’agents antimicrobiens.
En conclusion, en utilisant le séquençage 16S comme norme de référence, ils ont trouvé des preuves empiriques préliminaires soutenant l’utilisation d’un seuil de 10 000 UFC/mL pour le diagnostic des infections urinaires chez les jeunes enfants fiévreux.
