La definizione di urinocoltura positiva è stata oggetto di controversia per decenni. L’utilizzo di un valore limite di 100.000 unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL) per definire l’infezione del tratto urinario (UTI) nei pazienti adulti si basava in gran parte su un piccolo studio caso-controllo riportato da Kass1 nel 1956 in cui confrontava i risultati dell’urinocoltura da donne con pielonefrite clinicamente diagnosticata e controlli asintomatici; la maggior parte delle donne con pielonefrite aveva una conta delle colonie superiore a 100.000 CFU/ml e la maggior parte delle donne asintomatiche aveva una conta delle colonie inferiore a 10.000 CFU/ml.
Quasi 30 anni dopo, in uno studio trasversale su bambini piccoli sottoposti a cateterismo vescicale per escludere un’infezione delle vie urinarie, Hoberman e colleghi hanno confrontato le caratteristiche di bambini che avevano una crescita da 10.000 a 49.000 CFU/ml e da 50.000 a 99.000 CFU/ml.2 Tra i 35 campioni con crescita compresa tra 10.000 e 99.000 CFU/ml, crescita mista e/o cocchi Gram-positivi sono stati osservati più frequentemente tra i bambini con conte di colonie comprese tra 10.000 e 49.000 CFU/ml rispetto ai bambini con conte di colonie comprese tra 50.000 e 99.000 CFU /ml.
Da allora, il limite di 50.000 è stato il limite accettato per interpretare i risultati colturali dei campioni raccolti mediante cateterizzazione in bambini di età inferiore a 2 anni.3 Tuttavia, poiché in nessuno di questi 2 studi è presente uno standard di riferimento indipendente dalla coltura, è possibile essere considerati solo come chiarimenti4 e non possono fornire altro che approssimazioni di un limite che potrebbe essere utile nella pratica clinica.
Infatti, sono stati segnalati problemi con il limite pediatrico attualmente accettato di 50.000 CFU/mL. Un esempio notevole proviene da uno studio di Swerkersson et al. 5 in cui una percentuale considerevole di bambini piccoli con pielonefrite confermata radiologicamente presentava una conta delle colonie inferiore al limite attualmente accettato di 50.000 CFU/mL.
Per indagare i compromessi tra sensibilità e specificità ai vari punti di cut-off, è necessario uno studio trasversale in cui sia una urinocoltura (il test indice) sia uno standard di riferimento coltura-indipendente vengono eseguiti su campioni non selezionati provenienti da soggetti in per i quali è clinicamente ragionevole sospettare una infezione delle vie urinarie.
I recenti progressi nel sequenziamento 16S, che utilizza l’esatta sequenza del gene 16S ribosomiale (rRNA) altamente conservato per identificare i batteri presenti nei campioni, ci forniscono ora uno standard di riferimento sensibile e relativamente imparziale per l’identificazione di organismi nelle urine.
In uno studio precedente, hanno trovato un’elevata concordanza tra il sequenziamento convenzionale dell’amplicone del gene rRNA 16S dell’urinocoltura (di seguito denominato sequenziamento 16S) in una coorte di bambini piccoli (non sovrapposti alla coorte attuale) che vengono valutati per UTI. .6
In questa coorte di bambini giovani e febbrili sottoposti a cateterismo vescicale per escludere un’infezione del tratto urinario, utilizzando il sequenziamento 16S come standard di riferimento, gli autori hanno calcolato l’accuratezza della coltura convenzionale a diversi punti di cut-off per identificare quella che fornisce l’equilibrio ottimale tra sensibilità e specificità.
| Metodi |
Tra giugno 2019 e maggio 2020, hanno arruolato bambini consecutivi che si sono presentati al pronto soccorso dell’ospedale pediatrico di Pittsburgh con urina rimasta dopo aver completato tutti i test clinici. Lo studio è stato approvato dall’Institutional Review Board dell’Università di Pittsburgh.
I bambini sono stati inclusi se avevano un’età compresa tra 1 mese e 2 anni e 11 mesi, avevano febbre (temperatura documentata ≥ 38°C al pronto soccorso o dalla segnalazione dei genitori) entro 24 ore dalla presentazione e avevano effettuato un esame del sangue. campione di urina tramite catetere per escludere un’infezione delle vie urinarie.
Hanno escluso i neonati perché questo studio fa parte di uno studio più ampio che esamina i biomarcatori della pielonefrite. La diagnosi di pielonefrite si ottiene eseguendo una scansione renale, difficile da eseguire nei neonati.
I bambini sono stati esclusi se avevano ricevuto antibiotici sistemici o corticosteroidi entro 3 giorni prima dell’arruolamento, avevano altre infezioni batteriche sistemiche concomitanti, erano immunocompromessi, avevano una vescica neurogena o presentavano anomalie genitourinarie significative (ad esempio spina bifida, reni displastici). , reflusso vescico-ureterale di grado IV o IV).
L’urinocoltura convenzionale è stata eseguita nel laboratorio microbiologico clinico dell’ospedale utilizzando metodi microbiologici standard e il numero di unità formanti colonie (CFU)/mL è stato riportato come <10.000, da 10.000 a 49.000, da 50.000 a 99.000 e ≥ 100.000.
> Elaborazione di campioni di urina per il sequenziamento 16S
Un’aliquota di urina residua è stata utilizzata per il sequenziamento 16S. L’aliquota veniva generalmente prelevata entro 1 ora dal prelievo; tuttavia, se si prevedevano ritardi, i campioni venivano conservati refrigerati.
L’aliquota è stata congelata in una criovial a -80°C senza conservanti. Prima della spedizione, hanno aggiunto 70 µl di tampone di condizionamento delle urine (Zymo, D3061-1-8) per 1 ml di campione di urina congelata. I campioni sono stati spediti durante la notte in un pacco freddo al Pangea Laboratory, Tustin, California, USA, per l’analisi di sequenziamento 16S utilizzando il test microbico PrecisionBIOME NGS.
Il DNA è stato estratto dal campione urinario utilizzando il kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep secondo le istruzioni del produttore (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). Il DNA estratto è stato preparato per l’analisi del microbioma seguendo il flusso di lavoro PrecisionBIOME, che includeva la preparazione delle librerie utilizzando il kit Quick-16S NGS Prep Kit (regioni V1-3, Zymo Research Corporation, Irvine, CA), il sequenziamento di ampliconi con codice a barre con la piattaforma di sequenziamento MiSeq (Illumina , San Diego, CA) e analisi bioinformatica utilizzando la pipetta bioinformatica PrecisionBIOME in grado di produrre una risoluzione a livello di specie di sequenze batteriche e fungine (i dati sui funghi presenti e sulle citochine verranno riportati separatamente).
Sono stati inclusi i controlli negativi (solo mezzo di trasporto e tamponi non utilizzati). Per controllare la contaminazione, hanno incluso anche cellule e comunità di DNA simulato come controlli positivi. Possibili errori di sequenziamento e sequenze chimeriche sono stati rimossi con la pipetta DADA2.
> Elaborazione dati in sequenziamento 16S
Hanno utilizzato Uclust per eseguire classificazioni tassonomiche utilizzando un database personalizzato di PrecisionBIOME. Hanno calcolato i filotipi come proporzioni percentuali in base al numero totale di sequenze in ciascun campione.
La risoluzione a livello di specie di questo approccio di sequenziamento è stata precedentemente confermata dal sequenziamento shotgun.7 Abbiamo escluso campioni con <1000 sequenze per campione.
> Condizione target in fase di diagnosi
In uno studio precedente condotto tra il 2011 e il 2017,6 gli autori hanno riscontrato un elevato tasso di concordanza tra colture di urina convenzionali e sequenziamento 16S nell’identificazione dei batteri nelle urine. Stabilito ciò, gli autori hanno ritenuto che fosse ora appropriato, nel contesto di questo studio esplorativo, sostituire il sequenziamento 16S al posto dell’urinocoltura nella diagnosi di UTI (la condizione target).
Nella pratica clinica, oltre alla presenza di batteriuria nella coltura, per diagnosticare un’infezione delle vie urinarie è necessario un aumento dei marcatori infiammatori.3
Di conseguenza, per diagnosticare le infezioni delle vie urinarie nel contesto di questo studio di prova, oltre a richiedere che ≥80% delle sequenze appartenessero a un singolo taxon (cioè, abbondanza relativa di qualsiasi taxon ≥80%), richiedono anche la aumento dei marcatori urinari di infiammazione.
Nel costruire il loro standard di riferimento, gli autori hanno scelto un cut-off dell’80% (per l’analisi primaria) perché ritenevano che, come medici, sarebbero stati costretti a diagnosticare un’infezione delle vie urinarie in un bambino febbrile con marcatori urinari di infiammazione la cui urina era a questo livello. livello. di batteriuria.
Il resto dei bambini è stato classificato come “no UTI”. Come analisi di sensibilità, abbiamo anche esaminato i risultati utilizzando i limiti di abbondanza relativa del 50% e del 90%.
>Marcatori urinari di infiammazione
Ogni bambino è stato sottoposto ad un’analisi microscopica delle urine in cui sono stati osservati i globuli bianchi (WBC) (per millimetro cubo o per campo ad alto ingrandimento) e ad un dipstick test in cui è stato riportato il test dell’esterasi leucocitaria. forma semiquantitativa (nessuno, tratto, 1+, 2+, 3+).
Poiché la sensibilità sia dei test dei globuli bianchi che dell’esterasi leucocitaria è generalmente bassa,8 è stata misurata, utilizzando metodi utilizzati in studi precedenti, anche la lipocalina associata alla gelatinasi dei neutrofili (NGAL) in un’aliquota di urina residua.
L’NGAL è un marcatore infiammatorio rilasciato dai neutrofili o dalle cellule intercalate nel rene in risposta all’UTI.9,10 Sebbene l’uso dell’NGAL urinario per la diagnosi dell’UTI sia uno sviluppo relativamente recente, data la forte evidenza a sostegno del suo utilizzo per la diagnosi dell’UTI, 10 gli autori hanno deciso, a priori, di classificare un bambino come avente evidenza di infiammazione se era presente uno dei seguenti parametri: ≥10 WBC/mm3, ≥5 WBC per campo ad alto ingrandimento (Hpf), ≥tracce di esterasi leucocitaria o livello di NGAL maggiore superiore a 39,9 ng/mL.10 Hanno eseguito un’analisi di sensibilità esaminando i risultati se non avessero considerato NGAL come marcatore di infiammazione.
> Test indice nella valutazione
Gli autori hanno definito positivi i risultati della coltura convenzionale se l’urinocoltura mostrava la crescita di almeno 1 organismo con una conta di almeno 10.000 CFU/mL e se almeno 1 dei marcatori urinari di infiammazione era elevato. Altri punti limite valutati erano 50.000 CFU/ml e 100.000 CFU/ml.
> Analisi statistica
Per l’analisi primaria, hanno calcolato la sensibilità e la specificità dell’urinocoltura per rilevare le infezioni delle vie urinarie (utilizzando un cutoff di abbondanza relativa del 90% in un bambino con marcatori urinari di infiammazione), insieme ai corrispondenti intervalli di confidenza Wald del 95%. Hanno poi ripetuto le analisi utilizzando diverse definizioni di UTI (vale a dire, utilizzando i limiti di abbondanza relativa del 50% e 80% anziché del 90%). Hanno riassunto e analizzato i dati utilizzando la versione SAS 9.4 (SAS Institute Inc).
| Risultati |
In totale, sono stati inclusi nello studio 341 bambini. La maggior parte dei bambini arruolati erano donne (74%), bianchi (67%) e la maggioranza (64%) aveva una temperatura documentata di 39°C o superiore. L’età media dei bambini alla diagnosi era di 12,5 mesi e la temperatura media alla presentazione era di 39,3°C. Nei bambini con marcatori urinari di infiammazione ma senza almeno 1 organismo con una conta colturale di 10.000 CFU/mL o più, l’abbondanza relativa mediana dei organismi identificabili predominanti era del 15% (intervallo interquartile: 7%–32%).
Utilizzando un limite di abbondanza relativa dell’80%, 46 bambini in questo campione avevano una UTI. Di questi, 41 (89%) avevano E. coli come agente patogeno predominante. Quando viene utilizzato un cut-off ≥ 10.000 per definire un’urinocoltura positiva, tra 46 bambini con UTI, 45 sono stati correttamente identificati mediante urinocoltura convenzionale (sensibilità 98%, intervallo di confidenza [CI]: dal 93% al 100%).
Il bambino scomparso era un neonato di 4 mesi con esterasi leucocitaria 3+, una conta leucocitaria di 73 per Hpf, un NGAL elevato di 319, in cui >99% di sequenze sono state identificate mediante sequenziamento 16S assegnato alla specie. di Klebsiella . All’esame colturale, questo bambino aveva <10.000 CFU/ml di organismi gram-negativi e <10.000 CFU di cocchi gram-positivi; non sono stati identificati altri organismi a causa del basso numero di colonie. Dei 295 bambini senza UTI, 291 sono stati correttamente identificati come tali mediante coltura convenzionale (specificità del 99%, IC: da 97% a 100%).
L’utilizzo di un cut-off ≥50.000 CFU/ml ha ridotto la sensibilità dell’urinocoltura all’80% (IC 95%: 68%–93%). La modifica del valore limite a 50.000 ha avuto un effetto trascurabile sulla specificità (vale a dire, la specificità è rimasta al 99%, IC: 98%-100%). Gli 8 bambini in più con IVU che sarebbero stati persi se fosse stato utilizzato il limite di 50.000; tutti i bambini con infezioni delle vie urinarie mancate avevano organismi attualmente considerati uropatogeni e, per definizione, erano tutti sintomatici e avevano livelli elevati di marcatori urinari di infiammazione.
L’utilizzo di un valore limite di 100.000 CFU/mL avrebbe ridotto la sensibilità al 70% (IC 95%: 55%-84%). Le modifiche alla definizione dello standard di riferimento hanno avuto scarso effetto sulle stime di precisione.
Le stime di sensibilità e specificità sarebbero state simili se non avessero incluso NGAL come marcatore di infiammazione.
| Discussione |
Studi precedenti hanno tentato di comprendere i risultati dell’urinocoltura confrontando la conta delle colonie in condizioni estreme (ad esempio, pielonefrite rispetto a quella asintomatica) 1 o confrontando le caratteristiche dei soggetti a determinati limiti alto e basso della conta delle colonie.2
Tali disegni di studio, sebbene necessari durante le prime fasi esplorative della ricerca sui test diagnostici, non possono fornire una vera valutazione dell’accuratezza di un test nella pratica clinica, né possono essere utilizzati per identificare punti limite che ottimizzino la sensibilità e la specificità. 4
In questo caso, utilizzando il sequenziamento 16S come metodo gold standard per la diagnosi delle infezioni delle vie urinarie, gli autori sono stati in grado di valutare l’accuratezza diagnostica dell’urinocoltura a vari limiti di conta delle colonie.
Hanno scoperto che, nei casi di bambini febbrili di età inferiore a 3 anni sottoposti a cateterismo vescicale per escludere un’infezione delle vie urinarie, l’utilizzo di una conta delle colonie di 10.000 CFU/ml avrebbe comportato un minor numero di casi di infezioni delle vie urinarie mancate rispetto all’utilizzo di una conta delle colonie di 50.000 CFU. /mL (non riesce nel 20% dei casi) o 100.000 CFU/ml (non riesce nel 30% dei casi).
Secondo il disegno dello studio, tutti i bambini con mancata infezione delle vie urinarie avevano marcatori urinari elevati di infiammazione ed erano febbrili. Di conseguenza, i dati suggeriscono che un valore limite di 10.000 CFU/mL differenzia meglio i bambini piccoli con e senza una vera UTI.
Ci sono molte ragioni per cui il sequenziamento 16S, soprattutto se combinato con i marcatori urinari di infiammazione, è uno standard di riferimento adatto per la diagnosi di UTI.
Innanzitutto, a differenza dell’urinocoltura, che è ottimizzata per rilevare E. coli , l’analisi di sequenziamento 11 16S fornisce una valutazione ampiamente imparziale dei batteri presenti nelle urine. Infatti, un numero crescente di prove12,13 suggerisce che i risultati dell’analisi di sequenziamento 16S si allineano bene con i risultati dell’urinocoltura quantitativa espansa, una variazione più sensibile dell’urinocoltura che utilizza terreni di coltura aggiuntivi, volumi maggiori di urina per inoculare la coltura delle piastre , tempi di incubazione più lunghi e una varietà di condizioni atmosferiche.14,15
Tuttavia, sebbene i dati sulla maggiore sensibilità del sequenziamento 16S rispetto all’urinocoltura sembrino indiscutibili, la sua maggiore sensibilità potrebbe in teoria andare a scapito di una minore specificità, soprattutto a causa della fase di amplificazione richiesta. Pertanto, si potrebbe immaginare uno scenario in cui molti organismi clinicamente non rilevanti potrebbero essere identificati mediante il sequenziamento 16S, portando a un gran numero di diagnosi di UTI inappropriate.
In questo studio, tuttavia, l’uso del sequenziamento 16S (insieme ai marcatori infiammatori) ha rivelato che solo in 1 bambino non era stata riscontrata un’infezione delle vie urinarie. Ciò suggerisce che l’analisi di sequenziamento 16S (a una soglia di abbondanza relativa dell’80%) combinata con marcatori infiammatori di infiammazione, era uno standard di riferimento adatto da utilizzare in questo studio.
Quando hanno iniziato questo studio, gli autori erano preoccupati di utilizzare una misura relativa di abbondanza come riferimento standard. Tuttavia, i risultati (in questo studio e in quello precedente) mostrano che, per la diagnosi di UTI, l’abbondanza relativa del sequenziamento 16S e dei risultati assoluti della coltura erano sorprendentemente simili.
Gli autori hanno ipotizzato che affinché un agente patogeno come E. coli rappresenti l’80% o più di tutti i campioni letti nel sequenziamento 16S, il numero di copie del suo gene dovrebbe superare i conteggi combinati16 di tutti gli altri batteri normalmente presenti. come parte dell’urobioma per quattro. Pertanto, la soglia di abbondanza relativa dell’80% verrà raggiunta solo quando l’abbondanza assoluta di un uropatogeno sarà piuttosto elevata.
I risultati supportano l’uso continuato dell’urinocoltura (almeno un limite di 10.000 CFU/mL) nella popolazione in studio. Tuttavia, a causa dei continui progressi tecnologici in termini di precisione, velocità e costo del sequenziamento 16S, potrebbe presto essere disponibile nei centri clinici. Se ciò accadesse, l’identificazione degli organismi potrebbe essere ottenuta nel giro di poche ore invece che di giorni. Pertanto, è importante condurre studi comparativi per stabilire i pro e i contro dell’utilizzo di questa tecnologia in ambito clinico.
È necessario considerare diversi limiti di questo studio. Hanno utilizzato una definizione di UTI che richiedeva la presenza di sintomi, elevati marcatori urinari di infiammazione e un’elevata abbondanza relativa di organismi nell’analisi di sequenziamento 16S. Usare una definizione meno rigorosa (ad esempio, non richiedere marcatori urinari di infiammazione) avrebbe potuto portare a un tasso più elevato di UTI non rilevate, ma sarebbero stati meno sicuri che tutte queste UTI rappresentassero UTI in buona fede.
La scelta dell’80% come soglia di abbondanza relativa richiesta per definire le UTI, sebbene basata sui dati di un precedente studio degli autori, è stata, tuttavia, in una certa misura, arbitraria. Riconoscono che anche gli organismi meno abbondanti possono essere in grado di causare malattie importanti.
In breve, come dimostrato dall’analisi di sensibilità, il punto di cut-off scelto per l’analisi primaria ha avuto poca influenza sulle conclusioni. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che, nella maggior parte dei casi, i campioni erano dominati da sequenze di un singolo uropatogeno noto o presentavano un’abbondanza molto bassa di una varietà di organismi che, in studi precedenti, erano stati rilevati in campioni di urina di persone asintomatiche.14
I risultati si applicano direttamente solo ai bambini sottoposti a cateterizzazione vescicale per escludere un’infezione delle vie urinarie; Potrebbe essere necessario un limite più elevato per l’urinocoltura in caso di maggiore contaminazione, ad esempio correlata al metodo di raccolta. Gli autori non hanno utilizzato conservanti prima di congelare i campioni; Tuttavia, i campioni non sono mai stati lasciati a temperatura ambiente e i risultati non suggeriscono errori dovuti all’approccio utilizzato.
Il laboratorio clinico non ha riportato conteggi accurati delle colonie per le colture di urina convenzionali; Ciò avrebbe potuto essere utile per individuare la soglia di conteggio inferiore a 50.000 CFU/mL che ottimizzava al meglio la sensibilità e la specificità dell’urinocoltura. La maggior parte delle infezioni del tratto urinario in questo campione sono state causate da E. coli .
Sono necessari studi più ampi per esaminare ulteriormente l’accuratezza delle soglie di conteggio delle colonie per gli uropatogeni meno comuni.
Infine, il sequenziamento del 16S, sebbene meno distorto rispetto all’urinocoltura, può essere soggetto ad alcuni errori, soprattutto quando la biomassa nei campioni è relativamente bassa17; tuttavia, è improbabile che questi errori modifichino il modello osservato da uno in cui molti organismi sono presenti con abbondanze relativamente basse a uno in cui il campione è dominato da 1 organismo.
I punti di forza dello studio includevano l’arruolamento consecutivo di bambini sintomatici con sospetta infezione delle vie urinarie, l’uso di uno standard di riferimento basato su dati precedenti, l’esecuzione del test indice e dello standard di riferimento in tutti i bambini inclusi, l’uso di definizioni cliniche a priori, la utilizzo di controlli positivi e negativi durante l’estrazione e il sequenziamento e utilizzo di un approccio di sequenziamento convalidato.
Inevitabilmente, abbassando la soglia per la diagnosi di UTI da 50.000 CFU/mL a 10.000 CFU/mL aumenterà il numero di bambini erroneamente etichettati come affetti da UTI. Tuttavia, questo è appropriato perché (1) il numero di bambini falsamente etichettati come affetti da IVU sarà inferiore al numero di bambini con IVU mancate che verranno scoperti, e (2) le conseguenze negative derivanti dal mancato rilevamento di una IVU febbrile generalmente superano quelle di prescrivere un ciclo aggiuntivo di agenti antimicrobici.
In conclusione, utilizzando il sequenziamento 16S come standard di riferimento, hanno trovato prove empiriche preliminari a sostegno dell’uso di un valore limite di 10.000 CFU/mL per la diagnosi di UTI nei bambini piccoli con febbre.
