Die Cedars-Sinai-Forschung ist die erste, die krankheitsbedingte Veränderungen in der Hornhaut entdeckt und mögliche therapeutische Ansätze zur Korrektur der diabetischen Wundheilung vorschlägt.
Zusammenfassung Ziele/Hypothesen Diabetes ist mit epigenetischen Veränderungen verbunden, einschließlich DNA-Methylierung und miRNA-Veränderungen. Diabetische Komplikationen in der Hornhaut können aufgrund einer Funktionsstörung der limbalen epithelialen Stammzellen (LESC) zu anhaltenden Epitheldefekten und Wundheilungsproblemen führen. In dieser Studie wollten wir epigenetische Veränderungen in LESC-angereicherten diabetischen im Vergleich zu nicht-diabetischen menschlichen Limbalepithelzellen (LEC) entdecken und neue diabetische Marker identifizieren, die für eine Therapie zur Normalisierung der Hornhautepithel-Wundheilung und -Expression eingesetzt werden können. von Stammzellen. Methoden Menschliche limbale Epithelzellen (LECs) waren isolierte oder organkultivierte Hornhäute, die aus Autopsieaugen von nicht-diabetischen (59,87 ± 20,89 Jahre) und diabetischen (71,93 ± 9,29 Jahre) Spendern gewonnen wurden. Die Gruppen unterschieden sich statistisch gesehen nicht im Alter. DNA wurde aus LEC für die Methylierungsanalyse mit dem Illumina Infinium 850K MethylationEPIC BeadChip extrahiert, und Protein wurde für die Wnt-Phosphor-Array-Analyse extrahiert. Die Wundheilung wurde mithilfe eines Kratztests an LEC- oder 1-Heptanol-Wunden an Organkultur-Hornhäuten untersucht. Kultivierte Hornhäute aus Organen und LECs wurden mit WNT5A-siRNA, miR-203a-Mimetikum oder miR-203a-Inhibitor transfiziert oder mit rekombinantem Wnt-5a (200 ng/ml), DNA-Methylierungsinhibitor Zebularin (1–20 µmol/l) oder biologisch abbaubaren Nanobiokonjugaten behandelt (NBCs) basierend auf einem Polyäpfelsäuregerüst mit Antisense-Oligonukleotid (AON) für miR-203a oder einer durcheinandergemischten AON-Kontrolle (15–20 µmol/l). Ergebnisse Es gab eine signifikante unterschiedliche DNA-Methylierung zwischen diabetischen und nicht-diabetischen LECs. Der WNT5A-Promotor war in diabetischem LEC hypermethyliert, begleitet von einem deutlich verringerten Wnt-5a-Protein. Die Behandlung diabetischer menschlicher Limbalepithelzellen (LECs) und organkultivierter Hornhäute mit exogenem Wnt-5a beschleunigte die Wundheilung um das 1,4-fache (p<0,05) bzw. 37 % (p<0,05). und erhöhte die Expression von LESC und diabetischem Marker. Die Wnt-5a-Behandlung in diabetischen menschlichen Limbalepithelzellen (LECs) erhöhte die Phosphorylierung von Mitgliedern des nicht-kanonischen Ca2+-abhängigen Signalwegs (Phospholipase Cγ1 und Proteinkinase Cβ) um das 1,15-fache [p<0,05] bzw. 1,36-fache [p<0,05]. ], jeweils). Bei diabetischen LECs erhöhte die Behandlung mit Zebularin die Wnt-5a-Spiegel um das 1,37-fache (p<0,01) und stimulierte die Wundheilung in dosisabhängiger Weise mit einem 1,6-fachen Anstieg (p<0,01) nach 24 Stunden. Darüber hinaus verbesserte Zebularin auch die Wundheilung in Hornhäuten aus diabetischen Organen um 30 % (p<0,01) und erhöhte die Expression von LESC und diabetischen Markern. Durch die Transfektion dieser Zellen mit WNT5A-siRNA wurde die Stimulierung der Wundheilung durch Zebularin aufgehoben, was darauf hindeutet, dass seine Wirkung hauptsächlich auf der Hemmung der WNT5A-Hypermethylierung beruht. Die Behandlung organkultivierter Hornhaut- und diabetischer menschlicher Limbalepithelzellen (LECs) mit NBC verbesserte die Wundheilung um das 1,4-fache (p<0,01) bzw. 23,3 % (p<0,05). mit höherer Expression von LESC- und Diabetes-Markern. Schlussfolgerungen/Interpretation Wir liefern den ersten Bericht über epigenetische Veränderungen in diabetischen Hornhäuten, einschließlich der doppelten Hemmung von WNT5A durch DNA-Methylierung und miRNA-Aktion. Insgesamt handelt es sich bei Wnt-5a um einen neuartigen Wundheilungsstimulator des Hornhautepithels, der zur Verbesserung der Wundheilung und der Stammzellen in der diabetischen Hornhaut eingesetzt werden kann. |
Kommentare
Cedars-Sinai-Forscher haben neue Erkenntnisse darüber geliefert, wie Diabetes die Wundheilung im Auge verlangsamt, und dabei erstmals zwei Veränderungen in der Hornhaut identifiziert, die mit der Krankheit zusammenhängen.
Die in der Fachzeitschrift Diabetologia veröffentlichten Ergebnisse identifizierten außerdem drei therapeutische Wege, die diese Veränderungen umkehrten und die Wundheilungsfunktion der Hornhaut teilweise wiederherstellten, eine Entdeckung, die letztlich als Grundlage für neue Behandlungen für Diabetes dienen könnte.
„Wir haben herausgefunden, dass Diabetes mehr zelluläre Veränderungen hervorruft, als wir bisher wussten“, sagte Alexander Ljubimov, PhD, Direktor des Augenprogramms am Cedars-Sinai Board of Governors Institute for Regenerative Medicine und leitender Autor der Studie. „Die Entdeckung hat keinen Einfluss auf die Gensequenz, sondern beinhaltet spezifische DNA-Modifikationen, die die Genexpression verändern, sogenannte epigenetische Veränderungen.“
Mehr als 37 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten, 11 % der Bevölkerung, leiden an Diabetes, einer systemischen Erkrankung, die zu Nierenerkrankungen, Herzerkrankungen, Amputationen, Schlaganfällen und Nervenschäden führen kann. Die meisten Diabetes-Medikamente sind darauf ausgelegt, die Glukosetoleranz zu erhöhen oder verbrauchtes Insulin bereitzustellen, wirken sich jedoch nicht auf die molekularen und zellulären Veränderungen und die damit verbundenen Komplikationen aus.
Die neue Forschung identifiziert auch zum ersten Mal eine wichtige Rolle für Wnt-5a, ein sezerniertes Signalprotein, das nach Ansicht der Forscher für die Wundheilung in der Hornhaut und die Funktion von Stammzellen verantwortlich ist, also Zellen, die sich in viele Zelltypen differenzieren können. Zellen.
„Aktuelle Behandlungen behandeln nur die Symptome, daher besteht ein dringender Bedarf, die molekularen Mechanismen diabetesbedingter Wundheilungsprobleme zu verstehen“, sagte Dr. Ruchi Shah, Wissenschaftler in Ljubimovs Labor und Erstautor der Studie. . „Das Verständnis dieses neuartigen epigenetisch regulierten Wundheilungsmechanismus könnte zu therapeutischen Behandlungen führen, die Patienten helfen könnten, weitere langfristige Augengesundheitsprobleme zu vermeiden.“
Obwohl bei diabetischen Augenerkrankungen die Netzhaut im Mittelpunkt steht, leiden bis zu 70 % der Patienten mit Diabetes an Hornhautproblemen.
Bei fortgeschrittenem Diabetes werden Hornhautstammzellen funktionsunfähig und die Hornhaut heilt nach Verletzungen oder Eingriffen wie einer Kataraktoperation und einer Laserbehandlung bei diabetischer Retinopathie langsamer und weniger vollständig.
Um die in dieser Studie entdeckten epigenetischen Veränderungen zu identifizieren, die nicht von Geburt an in das Genom integriert sind, sondern erst später eingeführt wurden, verglichen Ljubimov und sein Team Zellen aus der Hornhaut von sechs Diabetikern mit denen von fünf gesunden Spendern. Sie fanden heraus, dass bei diabetischen Hornhäuten das Proteinprodukt des WNT5A-Gens unterdrückt war. Darüber hinaus fanden sie in Proben von Diabetikern einen Anstieg der microRNA, die WNT5A hemmt.
Anschließend schädigte das Wissenschaftlerteam kultivierte Hornhautzellen und Hornhautorgankulturen und testete drei Interventionen zur Normalisierung der Wnt-5a-Proteinexpression. Sie fügten das Wnt-5a-Protein direkt hinzu; führte einen DNA-Methylierungshemmer ein, der ursprünglich zur Behandlung von Krebs zugelassen war; und gezielte microRNA-Spiegel mit einem neuartigen Gentherapieansatz unter Verwendung einer nanoskaligen Verbindung. Das Team entwickelte die Verbindung, die synthetische Moleküle verwendet, um microRNA zu blockieren, als Ersatz für eine virale Gentherapie, die ihrer Meinung nach für Stammzellen toxisch war.
Die drei Therapiemethoden stimulierten in den Diabetikerproben die Produktion von Stammzellmarkern und verbesserten die Geweberegeneration, wodurch die Wundheilung beschleunigt wurde.
„Neue Therapien zur Umkehrung epigenetischer Effekte könnten die Hornhautfunktion verbessern und könnten auch bei anderen diabetischen Komplikationen von Bedeutung sein“, sagte Clive Svendsen, PhD, Direktor des Board of Governors des Institute for Regenerative Medicine und Mitautor der Studie. „Diese Arbeit trägt sicherlich dazu bei, das Fachgebiet voranzubringen.“
Die Forscher werden ihre Daten weiterhin analysieren, um die Mechanismen von WNT5A und anderen Genen im Zusammenhang mit der Wundheilung besser zu verstehen. Sie untersuchen auch eine Kombinationstherapie, die sowohl auf die Methylierung von microRNA als auch auf DNA abzielt, in der Hoffnung, dass sie die Wundheilung durch die Erhöhung des Wnt-5a-Proteins vollständiger normalisiert.
„Unser Ziel ist es, topische Medikamente mit verzögerter Freisetzung zur Heilung von Hornhautwunden zu entwickeln“, sagte Ljubimov. „Medikamente, die von der FDA (Food and Drug Administration) zugelassen sind und leicht angewendet werden können, könnten einer der vielversprechendsten Ansätze für künftige wirksame Therapien sein.“
Finanzierung: Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01EY013431482, R01EY031377, R01EY025377 und R01CA206220 unterstützt; und das Cedars-Sinai Board of Governors Institute for Regenerative Medicine.
