La ricerca Cedars-Sinai è la prima a scoprire cambiamenti legati alla malattia nella cornea e propone potenziali approcci terapeutici per correggere la guarigione delle ferite diabetiche.
Riepilogo Obiettivi/ipotesi Il diabete è associato a modificazioni epigenetiche tra cui la metilazione del DNA e i cambiamenti dei miRNA. Le complicanze diabetiche nella cornea possono causare difetti epiteliali persistenti e problemi di guarigione delle ferite dovuti alla disfunzione delle cellule staminali epiteliali limbari (LESC). In questo studio, abbiamo mirato a scoprire alterazioni epigenetiche nelle cellule epiteliali limbari umane (LEC) diabetiche rispetto a quelle non diabetiche arricchite con LESC e identificare nuovi marcatori diabetici che possono essere presi di mira per la terapia per normalizzare la guarigione e l’espressione della ferita epiteliale corneale. delle cellule staminali. Metodi Le cellule epiteliali limbari umane (LEC) erano cornee isolate o coltivate da organi ottenute da occhi autoptici di donatori non diabetici (59,87 ± 20,89 anni) e diabetici (71,93 ± 9,29 anni). I gruppi non erano statisticamente differenti in termini di età. Il DNA è stato estratto dal LEC per l’analisi della metilazione utilizzando Illumina Infinium 850K MethylationEPIC BeadChip e la proteina è stata estratta per l’analisi dell’array di fosfori Wnt. La guarigione delle ferite è stata studiata utilizzando un test di raschiamento su ferite LEC o 1-eptanolo su cornee in coltura d’organo. Le cornee in coltura provenienti da organi e LEC sono state trasfettate con siRNA WNT5A, mimico miR-203a o inibitore miR-203a o trattate con Wnt-5a ricombinante (200 ng/ml), zebularina inibitore della metilazione del DNA (1–20 µmol/l) o nanobioconiugati biodegradabili (NBC) basati su un’impalcatura di acido polimalico contenente oligonucleotide antisenso (AON) per miR-203a o un controllo AON strapazzato (15–20 µmol/l). Risultati È stata riscontrata una significativa metilazione differenziale del DNA tra LEC diabetici e non diabetici. Il promotore WNT5A era ipermetilato nella LEC diabetica accompagnato da una proteina Wnt-5a marcatamente ridotta. Il trattamento delle cellule epiteliali limbari umane diabetiche (LEC) e delle cornee coltivate in organi con Wnt-5a esogeno ha accelerato la guarigione delle ferite rispettivamente di 1,4 volte (p <0,05) e del 37% (p <0,05). e ha aumentato l’espressione di LESC e del marcatore diabetico. Il trattamento con Wnt-5a nelle cellule epiteliali limbari (LEC) umane diabetiche ha aumentato la fosforilazione dei membri della via non canonica Ca2+-dipendente (fosfolipasi Cγ1 e proteina chinasi Cβ; di 1,15 volte [p<0,05] e 1,36 volte [p<0,05 ], rispettivamente). Nelle LEC diabetiche, il trattamento con zebularina ha aumentato i livelli di Wnt-5a di 1,37 volte (p <0,01) e ha stimolato la guarigione delle ferite in modo dose-dipendente con un aumento di 1,6 volte (p <0,01) a 24 ore. Inoltre, la zebularina ha anche migliorato la guarigione delle ferite del 30% (p<0,01) nelle cornee coltivate da organi diabetici e ha aumentato l’espressione di LESC e marcatori diabetici. La trasfezione di queste cellule con siRNA WNT5A ha abolito la stimolazione della guarigione delle ferite da parte della zebularina, suggerendo che il suo effetto era principalmente dovuto all’inibizione dell’ipermetilazione di WNT5A. Il trattamento di cellule epiteliali limbari (LEC) umane corneali e diabetiche coltivate in organi con NBC ha migliorato la guarigione delle ferite rispettivamente di 1,4 volte (p<0,01) e del 23,3% (p<0,05). con maggiore espressione di LESC e marcatori diabetici. Conclusioni/interpretazione Forniamo il primo resoconto dei cambiamenti epigenetici nelle cornee diabetiche, inclusa la doppia inibizione di WNT5A mediante metilazione del DNA e azione del miRNA. Nel complesso, Wnt-5a è un nuovo stimolatore della guarigione delle ferite dell’epitelio corneale che può essere utilizzato per migliorare la guarigione delle ferite e le cellule staminali nella cornea diabetica. |
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I ricercatori del Cedars-Sinai hanno fornito nuove informazioni su come il diabete rallenta la guarigione delle ferite negli occhi, identificando per la prima volta due cambiamenti nella cornea legati alla malattia.
I risultati, pubblicati sulla rivista peer-reviewed Diabetologia , hanno anche identificato tre percorsi terapeutici che hanno invertito questi cambiamenti e ripristinato parzialmente la funzione di guarigione delle ferite della cornea, una scoperta che potrebbe in definitiva ispirare nuovi trattamenti per il diabete.
"Abbiamo scoperto che il diabete induce più cambiamenti cellulari di quanto sapessimo in precedenza", ha affermato Alexander Ljubimov, PhD, direttore dell’Eye Program presso il Cedars-Sinai Board of Governors Institute for Regenerative Medicine e autore senior dell’articolo. “La scoperta non influisce sulla sequenza genetica, ma comporta specifiche modifiche del DNA che alterano l’espressione genetica, note come alterazioni epigenetiche”.
Più di 37 milioni di persone negli Stati Uniti, l’11% della popolazione, soffrono di diabete, una malattia sistemica che può portare a malattie renali, cardiache, amputazioni, ictus e danni ai nervi. La maggior parte dei farmaci per il diabete sono progettati per aumentare la tolleranza al glucosio o fornire l’insulina impoverita, ma non affrontano i cambiamenti molecolari e cellulari e le complicanze associate.
La nuova ricerca identifica anche per la prima volta un ruolo importante per Wnt-5a, una proteina di segnalazione secreta che i ricercatori hanno ritenuto responsabile della guarigione delle ferite nella cornea e della funzione delle cellule staminali, cellule capaci di differenziarsi in molti tipi di cellule. cellule.
"I trattamenti attuali affrontano solo i sintomi, quindi c’è un urgente bisogno di comprendere i meccanismi molecolari dei problemi di guarigione delle ferite legati al diabete", ha affermato Ruchi Shah, PhD, scienziato del laboratorio di Ljubimov e primo autore dello studio. . “La comprensione di questo nuovo meccanismo di guarigione delle ferite regolato epigeneticamente potrebbe portare a trattamenti terapeutici che potrebbero aiutare i pazienti a evitare ulteriori problemi di salute degli occhi a lungo termine”.
Sebbene gran parte dell’attenzione sulle malattie oculari diabetiche sia rivolta alla retina, fino al 70% dei pazienti con diabete soffre di problemi alla cornea.
Nel diabete avanzato, le cellule staminali corneali diventano disfunzionali e la cornea guarisce più lentamente e in modo meno completo dopo lesioni o procedure come la chirurgia della cataratta e il trattamento laser per la retinopatia diabetica.
Per identificare i cambiamenti epigenetici scoperti in questo studio, cambiamenti che non sono integrati nel genoma dalla nascita ma sono stati introdotti successivamente, Ljubimov e il suo team hanno confrontato le cellule delle cornee di sei pazienti diabetici con quelle di cinque donatori sani. Hanno scoperto che nelle cornee diabetiche il prodotto proteico del gene WNT5A era represso. Inoltre, nei campioni diabetici hanno riscontrato un aumento del microRNA che inibisce WNT5A.
Il team di scienziati ha poi indotto lesioni alle cellule corneali in coltura e alle colture di organi corneali e ha testato tre interventi progettati per normalizzare l’espressione della proteina Wnt-5a. Hanno aggiunto direttamente la proteina Wnt-5a; ha introdotto un inibitore della metilazione del DNA, originariamente approvato per il trattamento del cancro; e livelli mirati di microRNA con un nuovo approccio di terapia genica che utilizza un composto su scala nanometrica. Il team ha sviluppato il composto, che utilizza molecole sintetiche per bloccare i microRNA, come sostituto di una terapia genica virale che hanno trovato tossica per le cellule staminali.
I tre metodi terapeutici, nei campioni diabetici, hanno stimolato la produzione di marcatori di cellule staminali e migliorato la rigenerazione dei tessuti, accelerando la guarigione delle ferite.
“Nuove terapie per invertire gli effetti epigenetici potrebbero migliorare la funzione corneale e potrebbero anche essere significative in altre complicanze diabetiche”, ha affermato Clive Svendsen, PhD, direttore del consiglio di amministrazione dell’Istituto di medicina rigenerativa e coautore dello studio. “Questo lavoro aiuta sicuramente a far avanzare il campo”.
I ricercatori continueranno ad analizzare i loro dati per comprendere meglio i meccanismi di WNT5A e di altri geni legati alla guarigione delle ferite. Stanno anche studiando una terapia combinata per colpire sia la metilazione dei microRNA che quella del DNA, nella speranza che possa normalizzare più completamente la guarigione delle ferite aumentando la proteina Wnt-5a.
"Il nostro obiettivo è sviluppare farmaci topici a rilascio prolungato per la guarigione delle ferite corneali", ha affermato Ljubimov. “I farmaci approvati dalla FDA [Food and Drug Administration] e che potrebbero essere facilmente applicati potrebbero rappresentare uno degli approcci più promettenti per future terapie efficaci”.
Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto dai numeri di sovvenzione del National Institutes of Health R01EY013431482, R01EY031377, R01EY025377 e R01CA206220; e il Consiglio dei governatori dell’Istituto di medicina rigenerativa Cedars-Sinai.
